@techreport{oai:miyazaki-u.repo.nii.ac.jp:00001849,
 author = {吉田, ナオト and Yoshida, Naoto and 吉田, 直人},
 month = {2020-06-21},
 note = {大腸菌とクリソタイルを蒸留水中で混合し､その50μlを2%アガーロース上に滴下し､ポリスチレン製のストリークバーを弾性体に押し当てた.ストリークバーに常に一定の垂直抗力を与える装置を開発し､ストリークバーには20-100gの垂直抗力が与えられた.この状態でアガロースには回転運動が与えられ､アガロース表面はストリークバーでこすり続けられ､すべり摩擦力が与えられた｡この操作を弾性体曝露と命名した.定常期の大腸菌細胞とプラスミド(pUC18)とクリソタイルを混合しBL寒天培地上にて弾性体曝露させると､細胞はプラスミドを取り込んで抗生物質耐性に形質転換することを見出した.形質転換効率が最も高いのは曝露時間が6秒以上､寒天濃度が2%､NaCl濃度が200mMの時であった.37℃ で培養した細胞を用いるよりも､30℃で培養したそれを用いる方が効率は10倍高かった.様々な条件を検討した結果､最終的には1μgのpUC18あたり10(6)個のオーダーで形質転換体が得られた.クリソタイルを介した大腸菌の形質転換は寒天培地表面にて20秒以下という短時間の乾燥という急激な物理的変化が必要である.
大腸菌10(7)個オーダーをクリソタイルとともに20mM NaCl溶液に懸濁させ､2%寒天培地上で弾性体曝露させ､その生存細胞をコロニーフォーミングユニットとして求めると､曝露時間が長くなるに従って生存菌数は漸次減少し､120秒の曝露後､生存菌数は10(4)個オーダーに減少
した｡曝露時間120秒で比較すると､クリソタイル懸濁細胞の方がクロシドライト懸濁細胞よりも生存細胞の減少は大きかった.寒天濃度が0.5%のLB培地上での120秒間の曝露においては生存細胞数の減少は起こらなかった.またクリソタイル濃度が高い程､弾性体曝露細胞の生存菌数は減少した.一方Bacillus subtilisをクリソタイルとともに弾性体曝露させた場合､その生存菌数の減少は見られなかった.細胞内にβガラクトシダーゼを発現した大腸菌をクリソタイルとともに弾性体曝露させ､細胞外に放出された酵素活性を測定した所､曝露時間が長くなるに従って､細胞外に放出される酵素量は増大した.クリソタイルとともに弾性体曝露させた大腸菌の走査型および透過型電子顕微鏡観察によるとクリソタイルがミサイルのように細胞膜に突き刺ささっている様子を捕らえることができた｡これらの実験結果からグラム陰性細菌をクリソタイルとともに弾性体曝露させると､クリソタイルが細菌細胞に突き刺さり､細胞が破裂することを意味している｡生存菌数は曝露時間の増大に伴って減少し､水分含量の高い寒天上における曝露では生菌数の減少は見られないことより､クリソタイルが細胞に突き刺さる推進力は摩擦力(sliding friction force)(Tribos shock)であると言える｡クリソタイルが大腸菌の形質転換を仲介するのは､pUC18を吸着したクリソタイルが細胞を穿刺し､破裂にいたる中間体のうち破裂をまぬがれた細胞が分裂を繰り返し形質転換が成立したと解釈できる.
弾性体曝露における大腸菌とクリソタイルの相互作用を明らかにし､クリソタイルの仲介に18よる大腸菌の形質転換機構をさらに明確にした.クリソタイル溶液中のクリソタイル粒子の分散はフローサイトメトリーにて調べた｡またBlue fluorescence protein を発現する大腸菌をクリソタイルとともに弾性体曝露させた.クリソタイルにはFITCがコンジュゲートした26merのDNAを吸着させ､弾性体曝露時の形態変化を蛍光顕微鏡で調べた.クリソタイルは濃度が高まると凝集体を形成し､大きく成長することがわかった.曝露時間の経過にともなって､大腸菌-クリソタイルけん濁液の水分は寒天中-浸透していくのでクリソタイル濃度が寒天表面上で上昇する環境が生まれる.寒天上ではクリソタイル凝集体は直径50μm以上に成長し､あたかもいがぐりのような形態を示すようになる.同時にこのいがぐり凝集体は大腸菌を付着させ､水分の寒天中への浸透にともなって増大する寒天とストリークバーの界面に生じる滑り摩擦力によって､クリソタイルは細胞に突き刺さると考えられる.この時にプラスミドをクリソタイルの表面に付着させておくと､大腸菌はプラスミドを取込んで形質転換する.クリソタイルが大腸菌の形質転換を仲介する現象は､遺伝子を接種する(植え付ける)といったイメージがふさわしい.},
 title = {細菌のクリソタイルアスベストを介したプラスミド取込み機構とその応用},
 year = {},
 yomi = {ヨシダ, ナオト}
}